Продолжение. В полном объеме с многочисленными иллюстрациями можно читать на сайте ПОЛИТ.РУ
http://polit.ru/article/2010/06/10/bacterium/ Эта концепция была разработана в результате изучения вариаций у бактерий. На сегодняшний день (напомню, работа опубликована в 1988 году) считается, что мутации возникают постоянно и спонтанно, не в связи со своей полезностью. "В этой статье, - пишет Кернс, - мы, с одной стороны, обозреваем историю того, как возникла идея спонтанных мутаций у бактерий, а потом делаем эксперименты, которые показывают, что, возможно, клетки все-таки могут контролировать, где и как у них происходят мутации”. Здесь сказано что-то очень важное: ведь как только вы начинаете контролировать, где у вас происходят мутации, вы переходите к ламарковскому механизму. Вы - сознательно или несознательно - выбираете, какие мутации у вас должны произойти, то есть они перестают быть спонтанными. От чтения этой статьи возникает ощущение, что Кернс решил попробовать сделать опыт, который был бы еще проще, чем у Лурии и Дельбрюка, но при этом был бы не менее, а более информативен. Цель его опыта - это попытка найти адаптивные мутации. Я сразу скажу, что опыт Кернса не удался, хотя в последней части лекции я постараюсь вас убедить, что адаптивные мутации у бактерий действительно существуют. Своей статьей Кернс вызвал большой переполох. На сегодняшний день эта статья цитировалась более чем тысячу раз. Национальными институтами здоровья и Национальным научным фондом США было потрачено не менее десятка миллионов долларов в виде грантов очень хорошим ученым, чтобы разобраться, что же все-таки происходит на самом деле. Так как эволюция вызывает сильные чувства у людей не только в России, но и в Америке, было забавно наблюдать, как на экспертной панели одного из Национальных институтов здоровья один ученый обзывал другого коммунистом из-за того, что их мнения по поводу этого эксперимента не совпали. А ведь в Америке худшего оскорбления просто не бывает. Так в чем же, собственно говоря, суть этой статьи? Мы будем отбирать lac+ колонии из lac– популяции все той же самой кишечной палочки. Что это значит на человеческом языке? Оказывается, что у бактерий существует фермент, который кодируется геном lac и этот фермент, продукт гена lac, необходим для того, чтобы клетка могла использовать сахар под названием лактоза как источник пищи. Нормальные клетки дикого типа называются lac+, и они образуют колонии на средах, содержащих лактозу как единственный источник пищи. Это и понятно — раз у них есть фермент, который позволяет использовать лактозу как пищу, то они, конечно, на среде, содержащей лактозу как единственный источник пищи, живут. С другой стороны, мутантные клетки, они называются lac–, не имеют такого фермента, не способны использовать лактозу как источник пищи и поэтому на средах, содержащих лактозу как единственный источник пищи, колоний не образуют. Среда, содержащая лактозу, будет в нашем эксперименте селективной средой. Клетки обоих типов растут на специальных индикаторных средах и образуют колонии разного цвета, при этом клетки дикого типа образуют колонии синего цвета, а мутантные lac– клетки образуют колонии белого цвета. Это все, что нам необходимо знать. Вот такая у нас будет экспериментальная система.
Экспериментальная система: отбор lac+ колоний из lac- популяции
Мы возьмем популяцию lac– клеток и будем отбирать lac+ клетки. У нас не будет 20 культур, как в прошлом опыте. У нас будет только одна чашка — вот она, показана на слайде.
На этой чашке помещена среда с лактозой как единственным источником пищи. Теперь мы на эту чашку высеем очень много lac– клеток, которые здесь расти не должны, потому что они не могут использовать тот источник пищи, который мы им предложили. Для образования видимой глазом колонии из одной клетки-основательницы достаточно ночи, 8-10 часов. По истечении этого времени мы ожидаем увидеть некоторое количество колоний, и эти колонии по определению будут lac+. Это колонии произошли из клеток, которые “ревертировали”, т.е. перешли из исходного состояния lac– в состояние lac+. Такой опыт до Кернса делали много-много раз. Вы вечером ставите чашку, на которую вы высеяли бактерии, в термостат, а утром приходите и считаете колонии. Посчитали - и дальше что-нибудь еще делаете, а чашки выкидываете или ставите в холодильник, где бактерии больше не растут. А Кернс решил их посчитать не только на следующий день, но еще и через день, и через 2 дня, и через 3 дня. Вот и весь его опыт. В чем здесь суть? Если мы считаем, что каждая из колоний, которая выросла на селективной среде, произошла из спонтанно возникших и ранее предсуществовавших lac+ клеток, то все lac+ клетки, которые были высеяны на чашку вечером, должны были образовать колонии на следующий день. А дальше количество колоний должно оставаться постоянным. Но оказывается, что если подождать 2 дня, то возникают еще колонии, три дня — еще. И вот, собственно, в правой части слайда перед вами единственная экспериментальная картинка из статьи Кернса в “Nature”. Из графика видно, что с течением времени наблюдается линейный рост количества колоний: чем больше вы эту чашку держите в термостате, тем больше lac+ колоний возникает. И так как все, что было на чашке с самого начала, должно было вырасти уже в течение первых суток инкубации, мы вынуждены признать, что каким–то образом клетки постепенно “приучаются” или “приручаются” использовать лактозу как источник пищи. Оказывается, что это изменения наследуемы. То есть те клетки, которые выросли во второй и третий день, действительно, lac+, они могут использовать лактозу, они и их потомки теперь все время будут на лактозе расти. Заметьте, что если мы сделаем опыт по Дельбрюку, если мы высеем клетки на среду с фагом, такого не произойдет. Никаких дополнительных колоний, устойчивых к фагу, с течением времени не возникнет. Возникает вопрос: в чем разница?
Реплика из зала: Одних съели, других — нет!
Константин Северинов (фото Н. Четвериковой)
Константин Северинов
(фото Н. Четвериковой)
Константин Северинов: На самом деле замечательно, что вы это почувствовали. Да, действительно, на чашках с фагом просто атомная война произошла. Все клетки, которые здесь не могли жить, их фаг убил — они просто исчезли. А в случае с лактозой ситуация другая — мы поместили клетки на среду без лактозы, у них нет еды, но отсутствие еды — это не смерть. По крайней мере, не быстрая смерть. Т.е. у нас здесь голодающие клетки сидят, голодают, с завистью смотрят на тех, кто начал расти с самого начала. А потом некоторые из них вдруг получают какой-то стимул, вдохновение - и тоже начинают расти...
Вопрос из зала: Голодная клетка один раз делится или может 2 раза делиться?
Константин Северинов: Она делится какое-то количество раз, но небольшое. Происходит несколько актов деления, да. Это вы в правильном направлении думаете.
Вопрос из зала: Насколько доказано, что все те клетки, которые были высеяны, действительно, lac–? Каким образом они очищаются? Быть может, там затесался lac+?
Константин Северинов: Ну, что значит “затесался”? Затесался — это все равно, что он спонтанно возник. Критерии чистоты микробиологической работы были разработаны еще Кохом в конце XIX века. Культура чистая, если она клональна, если она выделена из одной клетки. Всякая колония, выросшая на чашке, есть потомок единственной клетки. Перед высевом на чашку они у нас сразу и выросли. Те lac+ колонии, которые выросли в первый день на лактозе, ничем в принципе не отличаются от тех, которые здесь выросли на чашках с фагом. Это одно и то же. Это то, что предсуществовало и тут же пустилось в рост на соответствующих селективных средах. Потому что одним из них все равно, есть фаг или нет, а другим все равно, является ли лактоза единственным источником пищи.
Вопрос из зала: Вы хотите сказать, что два механизма присутствуют одновременно?
Константин Северинов: Это не я хочу сказать, это данные говорят. Но это не отменяет вопроса о том, каков механизм возникновения “поздних” lac+ колоний. Возможно, что колонии, возникающие на второй и на третий день, не такие, как предыдущие, у них есть что-то особенное, и такое ощущение, что клетки, которые их образуют, как-то знают, куда им двигаться. Они каким-то образом решают, что они должны стать lac+. Т.е. изменения в этих клетках адаптивны, они не предсуществуют, и, следовательно, они обязаны своим возникновением какому то ламарковскому механизму. Статья Кернса как раз и была попыткой показать, что могут быть адаптивные мутации.
Вопрос из зала: А разве те несчастные голодающие клетки, которые делятся 2-3 раза, могут образовать в результате мутаций такие колонии?
Константин Северинов: Нет, но давайте посмотрим, что происходит.
В чем разница двух опытов? В том, что в опыте Кернса клетки выживают, а в опыте с фагом — нет.
Селекция, которая производилась в опытах Кернса, по-научному называется селекцией в условиях стресса. Оказывается, что стресс, в нашем случае это голодание, вызывает гипермутабельность. Почему возникают мутации? Потому что ваша ДНК реплицируется не очень точно. Логично предположить, что если вам очень плохо, вы голодаете, но тем не менее реплицируете ДНК, то количество ошибок при репликации у вас возрастет, просто потому, что машина, которая реплицирует ДНК, начинает работать менее точно. В данной ситуации это оказывается полезным. Почему? Потому что увеличение количества ошибок увеличивает изменчивость. А увеличенная изменчивость дает дополнительный материал для отбора. Т.е. даже если исходные lac– клетки не содержали необходимых мутаций до высева на среду с лактозой, lac+ мутации могли возникнуть за счет пониженной точности репликации клеток, находящихся на разных стадиях голодания. Надо понимать, что это ненаправленный, т.е., дарвиновский процесс, в ходе которого увеличивается количество всех мутаций. Но из получающейся более разношерстной популяции можно-таки будет выбрать несколько ребят, которые стали такими, как нужно. Это первый механизм возникновения “адаптивных” кернсовских мутаций. Второй механизм называется “амплификация частично функционального мутантного lac гена”. Он более сложный. Я попытаюсь его объяснить; если я буду путаться, то вы, пожалуйста, прерывайте, а я тогда попробую еще раз. Дело в том, что опыт Кернса вовсе не такой простой, как кажется на первый взгляд. Этот опыт был сделан так, чтобы он сработал как надо. Дело в том, что тот испорченный lac ген, с которым работал Кернс, не был испорчен полностью, окончательно и бесповоротно. Продукт мутантного гена работал, но с эффективностью лишь в 2% от активности продукта lac-гена дикого типа. Ситуация схематически показана на слайде. Светло-голубая палочка обозначает испорченный lac ген; этот ген может с вероятностью P перейти в полностью функциональное состояние и, в результате, у вас образуется колония синего цвета. Помните, lac+ колонии образуют колонии синего цвета? — вот такая колония и показана на слайде. Такой переход из lac- в lac+ состояние приводит к образованию колоний, выросших в первый же день, а также колоний, образовавшихся позже за счет гипермутабельности при стрессе. Но существует и другой, более сложный процесс. Оказывается, в клетке вообще, а в особенности в конкретной экспериментальной системе, сознантельно использованной Кернсом, с определенной частотой может происходит дупликация, т.е., удвоение числа копий lac гена.
Реплика из зала: настройка!
Константин Северинов: Ну, настройка — да. На самом деле, с какой-то вероятностью любой ген клетки может дуплицироваться, то есть его может временно стать две, а не одна копия. Если происходит дупликация, то может произойти и дупликация дупликации, т.е., учетверение копийности гена. А теперь смотрите, что происходит. В обычной ситуации это не плохо и не хорошо, и у клетки есть специальные механизмы, которые следят за тем, чтобы лишние копии генов не накапливались, а удалялись. Если у вас есть сильно, но не до конца испорченная копия гена, как в случае нашего lac- гена, то если у вас станет этих копий две, то, наверное, особой разницы бактерия не почувствует. Но если у вас будет четыре копии, то четыре вот таких испорченных “Запорожца” хоть и не сделают “Мерседес”, но клетка почувствует себя несколько лучше, ведь четыре копии обеспечат 8% (2% х 4) от нормальной активности. И такой уровень активности может позволить клетке делиться не один или два раза, как вот кто-то сказал, а больше, и с течением времени образовать крохотную маленькую колонию на селективной среде с лактозой. Вот на слайде показана такая микроколония, сфотографированная в микроскоп, в которой находится 2375 клеток. А рядом для сравнения показана нормальная колония, видимая невооруженным глазом. А микроколония еле-еле растет на среде с лактозой, потому что низкий уровень активности lac-фермента едва позволяет клеткам существовать. Дальше происходит вот что - когда у вас клетка микроколонии делится, то в каждой дочерней колонии должны быть, естественно, четыре копии мутантного гена. Однако, множественные повторы нестабильны, и при делении может происходить явление, называемое сегрегацией, в результате которой может возникнуть ситуация, когда у дочерней клетки стало две копии мутантого гена, а у другой — целых шесть! А шесть плохих копий гена - это уже почти хорошо, такие клетки начинают расти на селективной среде быстрее родительских. Процесс такой амплификации и селекции все более быстрорастущих бактерий может повторятся внутри растущей микроколонии несколько раз. В результате возникают вот такие, так называемые, секторные колонии. На индикаторной среде с лактозой они не белые, и не голубые, а какие-то пятнистые. Понятно, что сам по себе процесс амплификации с последующей селекцией быстрорастущих клеток внутри колонии полностью дарвиновский, но он занимает какое-то количество времени, так как он связан с этим муторным периодом медленного роста. В конце концов происходит еще одна вещь. Как мы помним, вероятность перехода из состояния lac- в состояние lac+ равна Р. Но если в результате амплификации у нас увеличилось количество копий lac- гена на клетку, то общая вероятность получения нормальной копии гена увеличивается пропорционально степени амплификации.
Вопрос из зала: Хоть одной копии?
Константин Северинов: Хоть одной. А дальше идет дарвиновский же процесс селекции против лишних плохо функционирующих копий. Если у вас есть одна нормальная копия, которая обеспечивает вам безбедное существование, то весь этот лишний груз, возникший в результате более ранней амплификации, очень быстро выкидывается за счет действия специальных молекулярных машин клетки. И вы очень быстро переходите в обычное lac+ состояние с одной копией нормального гена и образуете большую синюю колонию, которая “не помнит” про все те ужасы, через которые ей пришлось пройти, когда она была еще маленькой. Потребовалось около 15 лет работы очень хороших ученых, чтобы все это исследовать, понять, как это происходит на молекулярном уровне, и разобраться, что именно происходит в опыте Кернса.
Вопрос из зала: Получается, что нет ламарковского механизма?
Константин Северинов: Ну подождите, у меня 3 части. Но здесь ламарковского механизма нет.
Вопрос из зала: Я именно про этот сегмент и говорил.
Константин Северинов: Ну да, здесь нет... Зачем я вам все это рассказываю? Почему мы это должны знать, и, вообще, зачем этим заниматься? Интересно, что исследования кернсовских мутаций активно поддерживал Национальный институт рака. Более того, Кернс сам работает в Гарварде в департаменте раковой биологии. Причем здесь рак? Оказывается, что вот эти два процесса, которые я вам описал, гипермутация и амплификация отдельных генов у бактерий, тождественны тем процессам, с которыми многие из нас, к сожалению, когда-нибудь в своей жизни столкнутся, а именно процессам роста злокачественных опухолей. Возникновение опухолей - это многоступенчатый процесс, в результате которого происходит амплификация определенных генов, а также накопление новых мутаций за счет гипермутабельности. Связано это с тем, что маленьким раковым опухолям очень плохо: клетки в них голодают, специальные системы в организме с ними борются, иногда их еще лекарствами травят. Маленькая опухоль похожа на микроколонию, про которую мы только что говорили. А процесс происхождения крупной опухоли с развитием всего того, что доставляет нам массу неприятностей, происходит на молекулярном уровне по тем же принципам, что у lac- бактерий на среде с лактозой, только роль lac- клетки играет переродившаяся раковая клетка, а неблагоприятной средой является наш организм. В сущности, равитие опухоли — адаптивно. И увеличение злокачественности опухоли тоже адаптивно, с точки зрения опухоли, по крайней мере.
Теперь я перехожу к заключительной стадии, в ходе которой я постараюсь показать, что дело Ламарка живет и побеждает. Дельбрюк и Лурия показали, что это не так. Потом у нас был момент, когда мы думали, что есть таки ламарковский механизм, но это была лишь видимость. Теперь мы займемся изучением специальной системы, которая называется CRISPR/Cas. Открыта эта система была лет 20 назад, и вплоть до 2005-го года никто знать не знал, зачем она нужна. Тем не менее, такая система есть почти у всех бактерий. CRISPR/Cas локус (локус - это у генетиков место на хромосоме) имеет следующую структуру. Он состоит из участка ДНК, называемого CRISPR-кассетой, устройство которого показано на слайде. Имеется набор идентичных по последовательности повторов — они показаны ромбиками. В кассете, показанной на слайде, есть 30 ромбиков-повторов, каждый из которых имеет длину 30 нуклеотидных пар или три витка спирали ДНК. Между повторами находятся спейсеры, они все одинаковой длины, но разные по последовательности и показаны квадратиками. Рядом с CRISPR-кассетой, как правило, находятся специальные гены, их очень успешно изучал наш соотечественник Женя Кунин в Национальных Институтах Здоровья, эти гены называются Cas. Все, что было известно про эти гены до недавних пор, - это то, что про них ничего не известно. Они ни на что не похожи, но они почти всегда есть рядом с CRISPR-кассетами. Незнание функции чего-либо совершенно не является препятствием для его практического использования, часто даже наоборот. CRISPR/Cas является отличной иллюстрацией этого утверждения. Есть такая компания DANISCO — это крупная международная компания, которая занимается производством стартовых культур для молочной промышленности: сыр, йогурт, простокваша, очень много того, что мы едим, сделано с помощью стартовых культур, которые специалисты DANISCO разработали. Когда промышленник покупает у DANISCO бактерии и кладет их в большой чан с молоком, там начинается процесс брожения, в результате которого должен образоваться определенный молочный продукт. Понятно, что нужно уметь различать бактерии друг от друга. Для того, чтобы вместо рокфора у вас не получился чеддер. Но есть проблема. Иногда, когда вы устраиваете ферментацию на фабрике, делаете какой то сыр, вдруг откуда-то, буквально из воздуха прилетает бактериофаг и съедает всех ваших бактерий. И вы вынуждены все свое недобродившее молоко вылить, и понесете грандиозные убытки. На следующем слайде показана структура CRISPR-кассет различных промышленных штаммов бактерии Streptococcus thermophilus, с помощью которой деляют различные молочные продукты.
Система CRISPR/Cas
Видно, что у всех штаммов повторы одинаковые, а наборы спейсеров (индивидуальные спейсеры показаны разными цветами, при этом одинаковый цвет соответствует одинаковым спейсерам) очень разные, индивидуальные для каждого штамма. Иными словами, по данному локусу наблюдается грандиозная внутривидовая изменчивость: бактерия одна и та же, а CRISPR-кассеты у разных штаммов совсем разные. Это полезно, потому что это может быть использовано, чтобы надежно идентифицировать (иногда говорят “типировать") бактерии и отличать тех, которые делают рокфор, от тех, которые делают чеддер. Кроме того, если вы продали кому-то бактерию, которая делает рокфор, а потом узнали, что где-то в другой стране кто-то занялся своим производством рокфора, вы можете пойти туда, взять их бактерию и сказать: “Ага! А у вас набор спейсеров точно такой же, как у нас, мы считаем, что вы присвоили наш штамм!” Т.е. эта информация используется для патентования штаммов, что в принципе тоже очень полезная вещь. У нас в стране вариабельность CRISPR-спейсеров широко используется для типирования бактерий, вызывающих туберкулез.
Сейчас я рассажу в третий раз об эксперименте по селекции бактериальных мутантов. Этот эксперимент делали два ученых из DANISCO, Рудольф Барангу и Филипп Хорват. Они занамались скучнейшим делом, которым в современной университетской лаборатории никто бы им заниматься не дал. Они отбирали мутации устойчивости к бактериофагу у разных штаммов Streptococcus thermophilus.
Роль CRISPR/Cas в устойчивости бактерий к фагам
Понятно, что они это делали по причине острой производственной необходимости. Им нужно было найти такие бактерии, которые были бы устойчивы к фагам, но продолжали бы делать рокфор со всеми присущими ему вкусовыми качествами. Задачу эту они решили. По ходу дела они опубликовали несколько статей в самых лучших научных журналах мира и, кроме того, создали новый биотехнологический продукт, который сейчас уже выходит на рынок. Все это было сделано в течение трех лет. В сущности, они просто повторяли опыт Лурии-Дельбрюка, но только вариации их совсем не интересовали. Они просто брали бактерии, только Streptococcus thermophilus, а не кишечную палочку E. coli, и высевали их на чашку с фагами, а фаги были те, которые обнаруживались на “проблемных” молокозаводах и сыроварнях. Большинство бактерий, естественно, умирали, но вырастало некоторое количество устойчивых клеток. Предполагалось, что стартовые культуры, полученные на основе этих устойчивых клеток, можно будет использовать в промышленности и решить проблемы заражения бактериофагами. Но ученые DANISCO также хотели определить природу устойчивости бактерий к фагам, Помните, когда мы говорили про Е. coli, я сказал, что самый обычный механизм устойчивости - это когда вирус просто перестает узнавать бактерию, потому что поверхностные рецепторы на бактерии изменились. В случае с фагоустойчивыми мутантами Streptococcus thermophilus с этим все было совершенно нормально, т.е. вирусы с устойчивыми клетками (их называют Bim) совершенно замечательно связывались. Но вирусного потомства не возникало, и клетки жили. В чем же дело? Оказалась, что в Bim клетках CRISPR-кассета была изменена. А именно, в их CRISPR-кассетах произошло добавление одного повтора и одного спейсера. Самое замечательное было то, что для каждого нового спейсера (напомню - это участок ДНК длиной 30 нуклеотидов, три поворота спирали) обнаруживался идентичный участок в геноме того вируса, к которому приобреталась устойчивость. Что это значит?
Реплика из зала: Что клетка уже заражена.
Константин Северинов: Смотрите - вирус, конечно, маленький, но не такой маленький. Генетическая информация этого фага состоит из линейной молекулы ДНК длиной 40 тысяч пар нуклеотидов. А нас в BIM-ах добавился участок длиной лишь 30 нуклеотидов, но зато полностью соответствующий какому то участку вирусной ДНК.
Вопрос из зала: Для вируса он свой?
Константин Северинов: Кто свой?
Вопрос из зала: Вот этот мутант. Родной.
Константин Северинов: А что это значит? Вот опять же, если смотреть на данные и не переинтерпретировать их, имеющееся наблюдение говорит о том, что у устойчивых клонов происходит экспансия CRISPR-кассеты за счет включения участка генома соответствующего вируса.
Вопрос из зала: То есть я вас правильно понимаю, что это для защиты?
Константин Северинов: Я не знаю. Пока что я вам просто рассказываю об экспериментальном факте.
Вопрос из зала: Она заменяется там? Она удлиняется?
Константин Северинов: Нет, не заменяется, удлиняется. Вообще, отмеченная корреляция интересна, но не более того, пока вы не сделаете эксперимент, который сотрудники DANISCO сделали и опубликовали свои результаты в журнале “Science”. Эксперимент заключается вот в чем. Мы берем чувствительную к фагу клетку, генноинженерными способами направленно помещаем дополнительный участок ДНК, соответствующий геному вируса, в CRISPR-кассету - и смотрим, что произойдет. Стала ли клетка устойчивой к вирусу или нет. Оказывается, она действительно становится устойчивой!
Вопрос из зала: Любой участок вирусной ДНК или определенный?
Константин Северинов: Вообще говоря, не любой, но многие. Изо всего из этого возникает возникают два интересных вопроса. Первый — как происходит добавление спейсера в CRISPR-кассету зараженной клетки, ведь клетка должна быть заражена, чтобы она могла захватить участок фаговой ДНК? И второй вопрос — каким образом новый спейсер придает устойчивость к вирусу? На эту тему пока что почти ничего не известно. Понятно, что фрагмент вирусной ДНК, который станет спейсером, должен как то быть вырезан и каким то образом встроен в кассету. Происходит это с помощью продуктов тех самых Cas-генов, про которые никто ничего не знает. Эта первичная стадия приобретения спейсера называется адаптацией, ее сейчас очень активно изучают, но кроме того, что я вам сказал, ничего не известно. После того, как спейсер адаптирован в кассету, происходит “интерференция”, процесс подавления размножения вируса. Называется это интерференцией не просто так, а по аналогии с процессом РНК-интерференции, который был открыт в 1999 году. Это исключительно важный процесс в клетках высших организмов, о существовании которого никто раньше не подозревал.
Роль CRISPR/Cas в устойчивости бактерий к фагам
Первооткрыватели РНК-интерференции уже получили нобелевскую премию. Суть РНК-интерференции в следующем: если в клетке появился маленький участок рибонуклеиновой кислоты, который точно соответствует какому-то гену, то активность этого гена подавляется. Как это происходит, нам сейчас не важно, в этой области активно ведутся исследования, разрабатываются новые лекарства и т.д. Оказалось, что с CRISPR-кассеты делается РНК-копия, которая нарезается на маленькие участки РНК, и каждая такая маленькая РНК состоит из из полного спейсера и обрамляющих фрагментов повторов. И вот - если спейсерный участок такой короткой РНК полностью соответствует ДНК вируса, то заражение не происходит. Происходит интерференция. Непонятно, какой механизм, но так происходит.
Вопрос из зала: Получается, что та ДНК, которая приходит из вируса, не встраивается в геном клетки?
Константин Северинов: Что происходит, непонятно. Все, что мы знаем, - что клетка выживает. Если у вас происходит обычный процесс инфекции, то эта клетка обречена, она умрет.
Вопрос из зала: То есть он встраивает свой геном?
Константин Северинов: Он ничего не встраивает. Он просто вводит свой геном в клетку во время инфекции.
.
Вопрос из зала: Вирус начинает размножаться, а тут он блокирует все механизмы.
Константин Северинов: Это вы описываете то, что произошло, но как оно блокируется — непонятно. Инфекция блокируется непонятно, на какой стадии. Известно, что есть такие маленькие молекулы РНК из CRISPR-кассеты, и без них ничего не будет. Также известно, что если у вас есть полное соответствие между маленькой молекулой РНК и участком генома вируса, то заражения не будет. Все. Больше ничего не известно.
Вопрос из зала: А в каком смысле вы употребляете слово молекула — это действительно молекула или это образное выражение?
Константин Северинов: Это в том смысле, в котором фрагмент рибонуклеиновой кислоты (РНК) длиной 60 нуклеотидов является молекулой. Цепочка нуклеотидов РНК.
Вопрос из зала: Это похоже на механизм прививки?
Константин Северинов: Это называется адаптивной иммунностью. Это похоже на возникновение разнообразия лимфоцитов в нашей иммунной системе. CRISPR-имунность не изучена, но понятно, что ее можно использовать самыми интересными способами, я об этом еще скажу. Для нас важно, что этот механизм сугубо, полностью 100% ламарковский. Давайте опять проведем наш мысленный эксперимент. Вот у нас есть наша бактерия, вот у нее есть CRISPR-кассета. Наша клетка поделилась 4 раза, возникло 16 клеток, и мы к этой культуре добавили фаг, а у фага есть геном, содержащий участки, помеченные зеленым цветом, синим, рыжим и оливковым. А у бактерий таких участков в геноме нет. Они их могут взять только из этого вируса. В первом опыте у нас возникла одна устойчивая колония и оказывается, что в CRISPR-кассете клеток, ее образовавших, появился спейсер, соответствующий зеленому участку. Во втором опыте у нас возникла устойчивая колония из клеток с оливковым участком. В третьем бактерии с синим и рыжим участками появились, а в четвертом устойчивых клеток не возникло. Мы можем провести тест Лурии-Дельбрюка, так же, как они делали в 43-м году. Все, что у нас сменилось, — это организм. До этого у нас была кишечная палочка, а теперь у нас Streptococcus thermophilus. Мы можем сделать отпечатки с бархатным штампом. Что бы мы ни делали, результат будет полностью обратным тому, о котором я вам рассказывал вначале. Т.е. механизм совершенно ламарковский: приобретение признаков при изменении условий окружающей среды. Он другим и не может быть, потому что изменяющаяся среда в виде вируса и является источником информации о том, как с этим изменением бороться.
Устойчивость, вызванная CRISPR/Cas, чисто адаптивна (приобретение признаков наследуемых признаков под действием окружающей среды)!
- участник сейчас на форуме
- участник вне форума